Cours de Biochimie 3, de Microbiologie 2 et les laboratoires de Microbiologie 2 du Q1.

Cours de Biochimie 3, de Microbiologie 2 et les laboratoires de Microbiologie 2 du Q1.

- Donner une vision large des nombreux intérêts et applications du Génie génétique dans les biotechnologies.

- Étudier et comprendre les principaux outils et les principales techniques d’étude des acides nucléiques.

- Étudier et comprendre les différentes étapes du clonage d’un gène.

- Étudier et comprendre les caractéristiques des différents vecteurs de clonage et des différents vecteurs d’expression (de même que leurs avantages et leurs inconvénients) en bactéries, levures, cellules animales.

- Pouvoir construire une souche (procaryote versus eucaryote) recombinante exprimant une transprotéine d’intérêt (industriel vs thérapeutique vs écologique, …).

- Acquérir et intégrer les différents concepts du Génie génétique, pré requis indispensable à la compréhension des cours de Biochimie appliquée, de Génie biochimique, de Biochimie industrielle, …

- Outils utilisés pour l’étude des acides nucléiques : extraction, purification, centrifugations, quantification, enzymes, électrophorèses, séquençage, synthèse d’oligonucléotides, …

- Techniques utilisées pour l’étude des acides nucléiques : sondes (froides et chaudes), hybridations (Southern et Northern blot), PCR, RT-PCR, …

- Principales étapes du clonage d’un gène : préparation de l’ADN donneur, préparation de l’ADN receveur, modifications des extrémités, différents vecteurs de clonage et/ou d’expression, ligature de l’insert dans le vecteur, modes de transfert du vecteur recombinant dans les cellules hôtes, sélection des cellules recombinantes, …

- Différents vecteurs de clonage et/ou d’expression : caractéristiques, séquences utiles, avantages, inconvénients, analyses de cartes plasmidiques (plasmides synthétiques, vecteurs d’expression bactériens/levuriens/en cellules de mammifères (+ optimisation)), vecteurs navettes/shuttles, vecteurs phagiques de substitution-remplacement, cosmides, YAC, gènes rapporteurs, …

- Méthodes d'introduction des vecteurs recombinants dans des cellules hôtes, sélection, criblage et vérification des clones positifs.

- Illustrer les cours théoriques de Biochimie et de Génie génétique (ADN → ARNm → protéines → phénotype).

- Familiariser les étudiants aux techniques classiques de laboratoire en les sensibilisant particulièrement aux règles strictes de manipulation. Manipulation d’essai vs manipulation définitive.

- Former les étudiants à être autonome au sein d’un laboratoire de Génie génétique/Biochimie au point de vue organisationnel (gestion de son travail, du matériel et des produits).

- Former les étudiants à l’analyse des macromolécules (ADN, ARN, protéines) et les sensibiliser aux nombreux contrôles à effectuer), former les étudiants à l’expression des résultats et à l’interprétation rigoureuse de ceux-ci (cf. rédaction de rapports).

- Acquérir une démarche de pensée logique, analytique, pertinente et rigoureuse ; et développer son autonomie et son esprit critique dans la résolution de problèmes.

- Clonage complet d’un gène hétérologue (cf. gène « rapporteur » gfp codant la green fluorescent protein) : préparation d’ADN plasmidique (vecteur de clonage et vecteur d’expression), dosages, digestions par des endonucléases de restriction, électrophorèse sur gel d’agarose, analyse des profils obtenus, récupération et purification des fragments d’intérêt, ligature (directionnelle) de l’insert dans un vecteur d’expression inductible (à l’arabinose), …

- Transgénèse du vecteur recombinant dans une cellule hôte bactérienne : transformation thermique des bactéries (chimio compétentes).

- Criblage des clones positifs (sélection Amp®, « blanche-bleue », digestions, …) et amplification du candidat d’intérêt.

- Expression (inductible) transitoire et divers purifications (sommaires) de la protéine rapportrice correspondante (GFP).

- Manipulations annexes : extraction d'ADN génomique, PCR, …

- Exercices théoriques.

- L’enseignement est principalement de type magistral : exposé verbo-iconique (supporté par une projection de présentations PowerPoint).

- Méthode interactive : une participation active à chaque séance du cours est vivement recommandée.

- Une introduction repositionnant la manipulation dans son contexte théorique est réalisée en début de chaque séance.

- Les étudiants réalisent, individuellement ou en binôme, les manipulations précitées sur base des protocoles présentés dans le syllabus (préparation à domicile).

- Démonstrations pratiques.

- Le titulaire des TP passe « d’étudiant en étudiant ».

Aux termes du cours de Génie génétique, l'étudiant est capable de :

- De s’approprier les savoirs théoriques du Génie génétique et d’en maîtriser sa terminologie.

- De comprendre l’utilité et la praticité des principaux outils utilisés pour la « caractérisation des acides nucléiques : extraction, purification, centrifugations, quantification, enzymes, électrophorèses, séquençage, synthèse d’oligonucléotides, …

- De comprendre l’utilité et la praticité des principales techniques de base utilisées pour l’étude des acides nucléiques : sondes (froides et chaudes), hybridations (Southern et Northern blot), PCR, RT-PCR, … en apportant une attention particulière aux nombreux contrôles (positifs et négatifs) inhérents à l’interprétation des résultats.

- De développer et de maîtriser les différentes étapes d’une stratégie de clonage complète (cf. préparation de l’ADN donneur, choix du vecteur (de clonage vs d’expression), préparation de l’ADN receveur, modifications des extrémités, ligature de l’insert dans le vecteur, introduction du vecteur recombinant dans un hôte (intermédiaire vs final), sélection des cellules recombinantes, identification du clone recombinant d’intérêt, …).

- D’analyser les avantages et les inconvénients des différents vecteurs de clonage et/ou d’expression (constitutive vs inductible) en cellules bactériennes, levuriennes, de mammifères. 

- D’interpréter et de justifier l’utilité des différentes séquences nucléotidiques présentes sur la carte plasmidique d’un vecteur de clonage et/ou d’expression, de même que leur optimisation.

Aux termes des laboratoires de Biochimie, l'étudiant est capable de :

- De réaliser le clonage complet d’un gène : préparation d’ADN plasmidique (vecteur de clonage et vecteur d’expression), dosages, digestion par des endonucléases de restriction, séparation des produits de digestion sur gel d’agarose, analyse des profils obtenus, récupération et purification des fragments d’intérêt, ligature de l’insert dans un vecteur d’expression, …

- D’introduire le vecteur recombinant dans une cellule hôte bactérienne : transformation thermique des bactéries (chimio compétentes).

- De cribler les clones positifs (sélection Amp®, « blanche-bleue », digestions, …) et amplification du candidat d’intérêt.

- D’exprimer et de purifier (sommairement) la protéine d’intérêt.

- D’analyser qualitativement et quantitativement le produit du gène cloné : gels de protéines SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie, …

- De réaliser de manière autonome une expérience sur base du protocole fourni.

- De présenter de manière adéquate les résultats expérimentaux obtenus, de les analyser de manière rigoureuse et pertinente et de les interpréter en regards des résultats théoriques attendus. Validation des contrôles positifs et négatifs.

- De présenter une communication écrite de qualité.

- De répondre à différents questionnements : calculer un rendement d’extraction et de purification d’un plasmide, calculer la concentration d’un plasmide, de déterminer le profil de digestion d’un plasmide, choisir les meilleures enzymes, positionner des oligonucléotides sur une séquence nucléotidique, calculer un rendement de transformation, …